• Методи дослідження збудливих мембран
  
  
• Біофізика іонних каналів

РОБОЧА НАВЧАЛЬНА ПРОГРАМА КУРСУ

"МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ЗБУДЛИВИХ МЕМБРАН"

Метою курсу «МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ЗБУДЛИВИХ МЕМБРАН» є ознайомлення студентів з теоретичними та експериментальними підходами, які лежать в основі дослідження біоелектричної функції клітинних мемран. Вивчення курсу є необхідним етапом для закладання бази подальшої спеціалізації.

Завданням курсу є розуміння студентами теоретичних засад та опанування ними ключовими методичними підходами, які застосовуються для дослідження іон-транспортної та сигнальної функції клітинних мембран.

1. Теоретичні основи біоелектрогенезу

   1.1. Із історії біоелектрики.
   Досліди Гальвані. Перші вимірювання потенциалу пошкодження, струмів спокою та струмів дії. Розвиток методів вимірювання біопотенціалів. Теорії виникнення біоелектричних явищ.
   
   1.2. Мембранна теорія.
   Етапи становлення та розвитку мембранної теорії біоелектрогенезу. Структура, функція та властивості біомембран. Подтримання іонного гомеостазу клітини: активні транспортери та іонні канали. Іонна проникність біомембран. Ряди Ейзенмана. Рівняння Нернста. Природа потенціалу спокою та потенціалу дії. Теорія постійного поля. Рівняння Голдмана-Ходжкіна-Каца. Механизми селективності іонних каналів.
   
   

2. Методи електрофізіології

   2.1. Металічні электроди.
   Фізхімія металів в електролетах. Металічні електроди, їх призначення та електрохімічні властивості.. Зворотні електроди. Поляризація електродів. Рухливість іонів в электролітах. Соляні містки та дифузійні потенціали. Індиферентний електрод та способи його виготовлення.
   
   2.2. Внутрішньоклітинні вимірювання електричних потенціалів.
   Металічні мікроелектроди (МЕ): області іх вживання та недоліки. Виготовлення металічних МЕ. Скляні мікропіпетки та МЕ їх принципові відмінності. Структура та фізичні властивості скла. Типи скла. Фізико-хімічні властивості поверхні розділу скло/електроліт. Електричні параметри скляного МЕ та його еквівалентна схема. Природа виникнення потенціалу кінчика скляного МЕ. Типи вольт-амперних характеристик скляних МЕ. Заповнення скляних МЕ. Механічне та термичне загострення скляних МЭ. Багатоканальні скляні МЕ. Утримувач МЕ.
   
   2.3. Методи вимірювання біоелектричних сигналів.
   Загальна блок схема електрофізіологічної установки. Апаратура та прилади, які застосовуються в сучасних електрофізіологічних дослідженнях. Основні вимірювальні схеми. Блок схема електрофізіологічного підсилювача. Попередні підсилювачі, їх призначення та основні вимоги.
   
   2.4. Операційні підсилювачі (ОП) та їх параметри.
   Ідеальний ОП. Зворотній звязок в схемах на ОП. Основні схеми включення ОП та їх аналіз. Стабільність схем на ОП. Шумові властивості ОП.
   
   2.5. Метод фіксації струму.
   Способи пропускання фіксованого струму через мембрану. Поняття послідовного опору та його компенсація. Схема класичного експерименту Ходжкіна-Хакслі на аксоні кальмара. Типи експериментів, які проводяться методом фіксації струму та їх інтерпретація.
   
   2.6. Метод фіксації потенціалу.
   Критерії адекватності фіксації потенціалу. Просторова та часова фіксація. Поняття послідовного опору при фиксації потенціалу. Одно- та двух-МЕ фіксація. Електронні схеми фіксації потенціалу. Області застосування фіксації потенциалу.
   
   2.7. Обробка даних, одержуваних методом фіксації потенціалу.
   Способи розділення загального трансмембранного іонного струму на компоненти. Вольт-амперні характеристики (ВАХ) мембрани, миттєві ВАХ, струми протікання. Аналітичний опис ВАХ. Поняття про активацію, деактивацію та інактивацію струмів та відповідних їм каналів. Часова та стаціонарна активаці та інактивацяя струмів, способи їх вимірбвання та опису. Експериментальні протоколи, які застосовуються для визначення різних характеристик струмів. Воротні струми. Комерційна програма pCLAMP для сбору та обробки електрофізіологічних даних.
   
   2.8. Фіксація потенціалу на багатоклітинних препаратах.
   Тканини які утворюють клітинний синцитій. Щільові контакти. Поодинокий та подвійний сахарозний місток. Практичні обмеження та недоліки методів сахарозного містка. Способи врахування та пониження похибок методів сахарозного містка.
   
   2.9. Фіксація мембранного потенціалу на ізольованих клітинах.
   Фіксація мембранного потенціалу за допомогою двух внутріклітинних мікроелектродів. Фіксація мембранного потенціалу за допомогою одного внутріклітинного мікроелектроду. Переваги та недоліки кожного з методів фіксації потенціалу. Порівняння електронних схем одно- та двохмікроелектродної фіксації.
   
   2.10. Метод внутрішньоклітинної перфузії.
   Поєднання методів фіксації потенціалу та внутрішньоклітинної перфузії. Ряд сприятливих внутршньоклітинних аніонів. Внутршньоклітинна перфузія на основі пластикових знарядь (мікропипеток). Виготовлення пластикових знарядь. Послідовний опір. Модифікації метода внутрішньоклітинної перфузії. Аналіз шумів з метою визначення характеристик поодиноких каналів. Переваги та недоліки методу фіксації потенціалу в умовах внутріклітинної перфузії.
   
   2.11. Метод "patch clamp".
   Микроэлектроди та мікропіпетки. Метод внутрішньоклітинної перфузії з застосуванням скляних мікропіпеток як попередник методу "patch clamp". Основні характеристики та переваги методу "patch clamp". Шляхи досягнення гігаомних контактів між кінчиком мікропіпетки та мембраною. Конфігурації методу "patch clamp". Оцінка ефективності внутріклітинного діалізу в конфігурації "whole cell". Поняття про "перфорований" "patch clamp".
   
   2.12. Особливості електронної схеми методу "patch clamp".
   Претворювач струм-напруга, як основний елемент попереднього підсилювача. Вимоги до опору зворотнього звязку. Корекція полоси пропускання електронної схеми. Компенсація швидких та повільних перехідних процесів. Компенсація послідовного опору. Комерційно доступні підсилювачі "patch clamp", їх переваги та недоліки.
   
   2.13. Реєстрація активності поодиноких каналів.
   Поняття про шуми та способи їх оцінки. Джерела шуму в методі "patch clamp" та шляхи підвищення його чутливості.
   
   2.14. Компютерна обробка даних по активності поодиноких каналів.
   Пороговий детектор подій. Вплив полоси пропускання та частоти оцифровки на детекцію подій. Одержання часових та амплитудних характеристик поодиноких каналів. Пачечна активність. Відповідність характеристик макроскопічних струмів та поодиноких каналів. Створення кінетичної схеми роботи каналу по даним його елементарної активності. Коммерційна програма для сбору та обрабки даних по активності поодиноких каналів - pCLAMP.
   
   

3. Методи дослідження рекомбінантних каналів та рецепторів

   3.1. Молекулярно білогічні підходи до дослідження іонних каналів та рецепторів.
   Генетичний код та його звязок з первинною структурою білка. Біохімічне виділення мембранних білків. Способи клонування іонних каналів та рецепторів. Бібліотеки геномної та комплементарної ДНК. Вектори ДНК.
   
   3.2. Попередній аналіз клонованих каналів та рецепторів.
   Виведення первинної структури клонованого канала. Гидропатичний профіль та його звязок з топологією мембранного білка. Ідентифікація транс- и та позамембранних ділянок. Змійчаті диаграми. Дендрограми гомологічних каналів. Природа різноманіття однотипних каналів: гомологічні гени, альтернативний сплайсинг та редагування мРНК.
   
   3.3. Структурно-функціональний аналіз клонованих каналів та рецепторів.
   Основні родини клонованих каналів та рецепторів. Основні та службові субодиниці каналів. Гомо- та гетеромультимерні канали. Ідентифікація функціонально важливих ділянок. Внесення мутацій та функціональна експресія клонованих каналів та рецепторів.
   
   3.4. Характеристика систем для функциональної експресії экзогенних каналів та рецепторів.
   Иморталізовані клітинні лінії, їх одержання та культивування. Ооцити шпорцевої жаби Xenopus laevis, їх морфологія, процедура виділення та утримування.
   
   3.5. Методи введення генетичного материалу в експресійні системи.
   Способи трансфекції екзогенної ДНК в клітинні лінії. Маркери трансфекції. Транзієнтна та стабільна трансфекція. Інжекція сумарної мРНК, виділеної з різних тканин, та комплементарної мРНК клонованих каналів в ооцити Xenopus.
   
   3.6. Электрофізіологічні методи дослідження експресованих каналів та рецепторів.
   Электричні параметри ооцитів Xenopus. Двух-МЕ фіксація потенцалу на ооцитах Xenopus та її особливості. Методика "зрізаного ооцита". Метод скляної воронки для внутрішньоклітинної перфузії та фіксації потенциалу ооцитів Xenopus. "Patch clamp" в застосуванні до ооцитів. Метод макроскопічного "patch clamp". Коммерційна установка для одночасного электрофізіологічного дослідження багатьох ооцитів.
   
   

4. Методи флуорисцентної мікроскопії

   4.1. Оптичні вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію.
   Перші вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Люмінісцентні та флуорисцентні індикатори. Характеристика сучасних флуорисцентних індикаторів кальцію. Методи введення індикаторів в клітину. Формула Гринкевича-Чена для двуххвильового методу вимірювання абсолютної концентрації кальцію. Індикатори примембранної та органельної концентрациї кальцію.
   
   4.2. Інші флуорисцентні індикатори.
   Індикатори потенціалу. Використання зеленого флуорисцентного протеїну та його похідних для візуалізації каналів та рецепторів.
   
   4.3. Флуорисцентний мікроскоп.
   Блок схема флуорисцентного мікроскопа. Блок схема установки для флуорисцентних досліджень динамічних процесів. Суміщення флуорометричних та електрофізіологічних досліджень.
   
   4.4. Принципы конфокальної мікроскопії.
   Одно- та двохфотонний конфокальний мікроскопи, переваги та недоліки кожного з них. Дослідження ко-локалізації мембранних білків з використанням резонансного переносу енергії.
   
   4.5. Методи надшвидкого прикладання розчинів з використанням "caged" біологічно активних речовин.
   Методи надшвидкої зміни розчинів. Поняття про "caged" речовини. Вимоги до "caged" речовин. Способи введення "caged" речовин в клітину. Типи "caged" речовин. Електрофізіологічні експерименти з використанням "caged" речовин.
   
   4.6. Вимірювання екзоцитоза та секреції.
   Оцінка екзоцитоза по змінам ємності мембрани. Карбонові електроди. Амперометричні вимірювання секреції.
   
   4.7. Дослідження транспортних процесів в модельних мембранах.
   Склад та властивості штучних мембран. Ліпосоми та «плоскі» мембрани. Вбудова мембранних білків в штучні мембрани. Електрофізіологічні вимірювання на плоских мембранах.
   
   

Питання, які розглядаються на семінарських заняттях

• Практичні методи виготовлення хлорсрібних електродів.
• Практичні методи виготовлення індиференнтних електродів.
• Практичні методи виготовлення металічних мікроелектродів.
• Практичні методи покращення електричних параметрів скляних мікроелектродів.
• Операційні підсилювачі та їх характеристики.
• Реалізація конкретних схем на основі операційних підсилювачів.
• Методи одержання ізольованих клітин.
• Практичні методи оцінки швидкодії та просторової однорідності фіксації потенціалу.
• Виготовлення пластикових електродів для внутрішньоклітинної перфузії.
• Практичні методи виготовлення скляних мікропіпеток для методу "patch clamp".
• Методи швидкої аплікації біологічно активних речовин на клітину в електрофізіологічному експерименті.
• Ізоляція та інжекція ооцитів шпорцевої жаби Xenopus laevis.

Можливі теми контрольних робіт

1. Теоретичні та практичні аспекти фіксації струму та фіксації потенціалу.
2. Аналіз потенціалзалежності та кінетики іонних струмів.
3. Оцінка селективності іонних каналів.
4. Особливості електронної схеми методу "patch clamp".
5. Конфігурації методу "patch clamp".
6. Технологічні аспекти виготовлення електродів для методу "patch clamp".
7. Геометричні параметри мікропіпеток та мембранних фрагментів.
8. Принципи аналізу та інтерпретації активності поодинокого каналу.
9. Ізоляція та культивування клітин з різних типів тканин.
10. Електрофізіологія на багатоклітинних препаратах.
11. Ооцити Xenopus та їх використання для функціонального тестування клонованих каналів.
12. Підходи до структурно-функціонального аналізу клонованих каналів.
13. Флуорисцентна мікроскопія.
14. Кальцій-чутливі флуорисцентні барвники.
15. Конфокальна мікроскопія.

Можливі теми курсових робіт

1. Функціональні та молекулярні типи кальцієвих каналів.
2. Фармакологія низькопорогових кальцієвих каналів.
3. Гетерогенність калієвих каналів.
4. Роль калієвих каналів в реполяризації серцевого потенціалу дії.
5. Хлорні струми в регуляції об"єму клітини.
6. Родина TRP каналів.
7. Природа термічної чутливості.
8. Характеристика калієвих каналів, задіяних в підтриманні потенціалу спокою клітин.
9. Шляхи входу кальцію в незбудливих клітинах.
10. Низькопорогові кальцієві струми в таламічних нейронах.

Навчально-методичні матеріали

"Біофізика іонних каналів"

1. Історія вивчення структурної організації мембранних іонних каналів та рецепторів (МІКР). Основні методичні підходи до клонування МІКР. Аналіз топології клонованих МІКР. Системи для функціональної експресії МІКР - ооцити Xenopus та клітинні лінії. Електрофізіологічні методи дослідження експресованих МІКР.
   
   
2. Надродина іонотропних рецепторів (нікотиновий АХ рецептор - нАХР, ГАМКА рецептор, серотоніновий рецептор, гліциновий рецептор). Функціональні типи нАХР - м"язеві та нейрональні. Фармакологія нАХР - конкурентні та неконкурентні блокатори. Біохімічне виділення та молекулярне клонування нАХР. Субодинична структура нАХР.
   
   
3. Первинна структура субодиниць нАХР. Мембранна топологія нАХР. Структурно-функціональні відносини в нАХР. Ідентифікація ділянок, які формують пору канала та місця звязування блокаторів.
   
   
4. Клонування серотонінового, ГАМКа та гліцинового рецепторів. Субодинична структура та стехіометрія цих рецепторів. Молекулярні детермінанти, які визначають катіонну або аніонну провідність рецепторів, місця звязування агоністів та антагоністів.
   
   
5. Іонотропні пуринові рецептори. Класифікація, субодинична структура та стехіометрія пуринових рецепторів.
   
   
6. Глутаматні рецептори. Класифікація функціональних типів глутаматних рецепторів. Особливості рецепторів NMDA типу (кальцієва провідність, блокування магнієм, ко-активація гліцином). Функціональні особливості АМPА-каінатних рецепторів.
   
   
7. Клонування глутаматних рецепторів. Субодиниці NMDA рецепторів, їх класифікація, первинна структура та топологія. Субодиниці АМPА-каінатних рецепторів, їх класифікація, первинна структура та топологія. Молекулярні ділянки структури субодиниць глутаматних рецепторів, які визначають їх іонпровідні властивості, дію агоністів та блокаторів.
   
   
8. Метаботропні рецептори. Їх класифікація. Механізм передачі сигналу від метаботропних рецепторів. Роль G білків. Основні риси молекулярної структури метаботропних рецепторів. Ділянки структури, які відповідають за звязування агоністів та взаємодію з G білками.
   
   
9. Потенціалозалежні іонні канали - Na⁺, K⁺, Ca²⁺. Методи оцінки основних функціональних характеристик каналів - кінетики, потенціалозалежності активації та інактивації, селективності. Воротні струми. Оцінка ефективного заряду воротних часточок.
   
   
10. Na⁺ канали. Фармакологія Na⁺ каналів. Функціональні типи Na⁺ каналів. Біохімічне виділення та клонування Na⁺ каналів. Субодинична структура різних типів Na⁺ каналів. Первинна структура та топологія основної пороформуючої α субодиниці Na⁺ каналів. Роль додаткових субодиниць.
    
    
11. Структурно-функціональні відносини в α субодиниці Na⁺ каналу. Ідентифікація сенсору потенціалу. Молекулярні ділянки структури α субодиниці, які утворюють пору каналу, відповідають за звязування блокаторів (ТТХ, локальних анестетиків) та інактивацію.
    
    
12. Сa²⁺ канали. Функціональні типи Сa²⁺ каналів (низько та високопорогові, L-, N-, P/Q-, R- та Т-типів). Фармакологія Сa²⁺ каналів. Функціональна роль різних Сa²⁺ каналів в клітинних процесах та їх тканинне розповсюдження.
    
    
13. Біохімічне виділення та клонування Сa²⁺ каналу зі скелетного м'язу. Субодинична структура Сa²⁺ каналу. Первинна структура та топологія основної пороформуючої α1 субодиниці Сa²⁺ каналу. Роль β та інших додаткових субодиниць. Різноманітність генів α1 субодиниці Сa²⁺ каналів та їх класифікація. Співставлення клонованих каналів функціональним типам.
    
    
14. Структурно-функціональні відносини в α1 субодиниці Сa²⁺ каналів. Ідентифікація сенсору потенціалу. Молекулярні ділянки структури α субодиниці, які утворюють пору каналу, відповідають за звязування блокаторів (дігідропірідінів, фенілалкіламінів та токсинів), потенціалозалежну та кальційзалежну інактивацію. Молекулярні детермінанти, які визначають кальцієву селективність. Роль Са²⁺ каналів в набутих та спадкових патологіях.
    
    
15. К⁺ канали. Функціональні типи К⁺ каналів. Фармакологія К⁺ каналів. Функціональна роль різних типів К⁺ каналів в клітинних процесах.
    
    
16. Клонування К⁺ каналу Shaker типу. Субодинична структура К⁺ каналу. Первинна структура та топологія основної пороформуючої α1 субодиниці К⁺ каналу. Роль β субодиниць. Різноманітність α1 субодиниць К⁺ каналів та їх класифікація (потенціалозалежні, внутрішнього випрямлення, фонові). Співставлення клонованих каналів функціональним типам.
    
    
17. Структурно-функціональні відносини в α1 субодиниці K⁺ каналів. Молекулярні ділянки структури різних типів α1 субодиниць, які утворюють пору каналу, відповідають за звязування блокаторів та інактивацію. Роль K⁺ каналів в набутих та спадкових патологіях.
    
    
18. Хлорні канали. Потенціалзалежні хлорні канали ClC типу, їх первинна структура, топологія, класифікація та роль в патологіях. Хлорні канали, задіяні в регуляції об'єму клітини. Молекулярні кандидати на роль об'ємрегульованих хлорних каналів. П-глікопротеін та транспортери АВС типу. CFTR хлорний канал, його структура, топологія та роль в спадковому пухирьчатому фіброзі легенів.
    
    
19. Катіонні канали TRP типу. Клонування TRP каналів. Різноманітність механізмів активації TRP каналів. Первинна структура, топологія та класифікація TRP каналів. Роль TRP каналів в депо-залежному вході кальцію. Роль TRP каналів в патологіях.